05 Moléculas de Histocompatibilidad 

(Ver capitulo actualizado en www.inmunologiaenlinea.es

R. Solana, N. Fernandez,  R. González, M. José García y J. Peña

 


Estructura Distribución Genetica Función Tipaje  y enfermedad Sistema H-2


INTRODUCCION

Las moléculas de histocompatibilidad fueron inicialmente descubiertas por ser las principales responsables de las reacciones de rechazo de tejidos trasplantados entre individuos de la misma especie. Los loci genéticos reguladores de la síntesis de estos antígenos se agrupan en una región denominada Complejo Mayor de Histocompatibilidad (MHC) y se heredan de acuerdo con las leyes de Mendel. Una de las principales características de estas moléculas es su extraordinario polimorfismo. Hoy día se considera que las moléculas de histocompatibilidad tienen como función principal recoger péptidos del interior de la célula, transportarlos a la superficie celular y allí presentarlos a las células T.

Las moléculas de histocompatibilidad se localizan en la superficie de las células de las distintas especies animales. En el ratón se denominan antígenos H‑2 y los genes que las codifican se localizan en el cromosoma 17. En el humano se denominan antígenos HLA (Human Leucocyte Antigens) y están codificadas por genes ubicados en el brazo corto del cromosoma 6. Los primeros trabajos sobre los antígenos H‑2 fueron realizados por Gorer (1936) en cepas murinas endogámicas (inbred), obtenidas por el cruce entre animales hermanos de forma continuada durante al menos 20 generaciones. El rechazo de trasplantes entre animales de distintas cepas endogámicas y la obtención de aloantisueros mediante inmunización de animales de una cepa con células de otra, permitieron una primera definición de este sistema genético.

En el caso humano, el primer antígeno de histocompatibilidad descrito fue Mac (en la actualidad definido como HLA‑A2), descubierto por Jean Dausset en 1958 (Figura 5.1). Pronto se vio que existía una relación entre estos antígenos y la supervivencia de riñones trasplantados.

En la actualidad, son ya centenares los antígenos de este tipo que se han definido gracias a las intensas colaboraciones establecidas entre los laboratorios que trabajan en histocompatibilidad, a través de los  Workshops Internacionales de Histocompatibilidad que desde 1964 se celebran periódicamente.

En este capítulo estudiaremos la estructura de estas molécu­las y la organización de los genes que las codifican. Su función en el procesamiento y presentación de péptidos se estudiará en el capítulo siguiente.

ESTRUCTURA DE LAS MoLÉCULAS DE HISTOCOMPATIBILIDAD    

Según su estructura las moléculas de histocompatibilidad se dividen en dos grandes grupos: moléculas de clase I y moléculas de clase II que se encuentran codificadas por regiones genéticas distintas dentro del MHC y desempeñan distintas funciones inmunológicas (Figura 5.2). Las principales moléculas de histocompatibilidad humanas quedan reflejadas en la tabla 5.1.

 Estructura de las moléculas HLA de clase I.

Las moléculas de los antígenos de histocompatibilidad de clase I (Figura 5.3), tanto en el sistema HLA como en el H‑2, se hallan constituidas por 2 cadenas polipeptídicas: una cadena pesada, glicosilada, de mayor tamaño, con un peso molecular de 45 kD, que se encuentra asociada, mediante interacciones no covalentes a una cadena ligera, la beta‑2‑microglobulina que tiene un peso molecular aproximado de 12.5 kD.

La beta‑2‑microglobulina, polipéptido idéntico al componente sérico normal, es idéntica en todos los individuos de la misma especie y los genes que la codifican  no se encuentran en el MHC, situándose en el cromosoma 16, en el hombre y en el cromosoma 2 en el ratón. El análisis estructural de la beta‑2‑microglubulina revela que pertenece a la superfamilia de las  inmunoglobulinas, con una notoria homología con el tercer dominio constante de la cadena pesada de las inmunoglobulinas. La cadena pesada, por el contrario, es altamente variable entre individuos de la misma especie, siendo la responsable del polimorfismo antigénico de las moléculas de histocompatibilidad clase I (Figura 5.4).  Se distinguen tres zonas bien definidas, una zona extra­celular de mayor tamaño  en la que se encuentran los determinan­tes antigénicos de la molécula, una pequeña región transmembrana, hidrófoba, y finalmente una región intracitoplasmática de unos 35 aminoácidos.

La zona extracelular se halla organizada en tres dominios de aproximadamente unos 90 residuos cada uno, denominados alfa-1, alfa-2 y alfa-3 mantenidos por la existencia de puentes intracatenarios. Los residuos glucídicos se encuentran unidos a la asparagina en la posición 86 del dominio alfa-1. Los dominios alfa-1 y alfa-2  constituyen regiones de contenido variable en aminoácidos, es decir son las zonas donde radica la variabilidad de la molécula. Por el contrario el dominio alfa-3 es bastante constante, pertenece a la superfamilia de las Igs y por tanto muestra una notable homología con la región constante de las inmunoglobulinas y con la beta‑2‑microglobulina  

Estructura de las moléculas HLA clase II. 

Las moléculas de clase II son glicoproteínas que se encuentran en la superficie celu­lar. Están formadas por dos cadenas, ambas con un dominio transmembrana, denominadas cadena a o pesada y cadena b o ligera, asociadas entre sí mediante interacciones de naturaleza no covalente. Tanto la cadena a como la cadena b se encuentran codifica­das por genes situados en el MHC.

La cadena a tiene un peso molecular aproximado de 33kD y la cadena b de 29 kD. Ambas cadenas tienen una organización semejante. Están constituidas por dos dominios extracelulares y se conocen con las denominaciones de a-1 y a‑2 en la cadena pesada y  b‑1 y b‑2 en la cadena ligera. Cada uno de estos dominios consta de 90‑96 aminoácidos. El dominio a‑1 es abierto mientras que los dominios alfa-2, beta‑1 y beta‑2 se pliegan mediante un puente disulfuro cada uno de ellos. Cuando se analizan los aminoácidos de las cadenas ligeras, se observa que los dominios a‑2 y b‑2 pertenecen a la superfamilia de las Igs, mientras que los a‑1 y b‑1, que son los que presentan mayor diversidad presentan homología con los dominios alfa-1 y alfa-2 de los antígenos clase I. Se aprecian tres zonas donde es más frecuente la variabilidad. Un tercer dominio corresponde a la región de cada cadena que atraviesa la membrana celular, contiene unos 30 aminoácidos y es de naturaleza hidrofóbica. Finalmente, el cuarto dominio, corresponde a la parte  citoplasmática de la molécula, es de naturaleza hidrofílica y contiene de 10 a 16 aminoácidos..

Estructura tridimensional. 

El análisis de la estructura tridimensional de los antígenos de histocompatibilidad de clase I y clase II, determinada mediante cristalografía, demuestra que los dominios están estructurados de forma diferente. Así, dentro de los antígenos clase I, el dominio alfa-3  y la beta‑2‑microglobulina están organizados en estructura  de hoja plegada b. Por el contrario los dominios a1 y a2 constan cada uno de ellos de una sola zona forma­da por cuatro fragmentos  en estructura de hoja plegada b seguido de otro segmento organizado en  forma de a-hélice. Esta organización delimita una hendidura denominada sitio de unión al péptido (peptide binding groove) en el que los residuos más polimórficos se encuentran en el suelo y las paredes de la hendidura. En esa hendidura se localiza un péptido que no pertenece a la molécula y de aproximadamente 8‑10 aminoácidos. Ese péptido procede de proteínas endógenas, como veremos en el capítulo siguiente e interacciona con las moléculas de histocompatibilidad mediante fuerzas no covalentes entre sitios concretos de ambas estructuras. Un determinado antígeno de histocompatibilidad puede unirse a péptidos diferentes siempre que éstos posean uno o varios motivos que interaccionen con zonas de la molécula cuya estructura suele estar condicionada por residuos polimórficos.

La estructura tridimensional de los antígenos de clase II también ha sido determinada por cristalografía y es semejante a la de los antígenos de clase I. Los dos dominios proximales (a2 y b2) son los equivalentes al dominio alfa-3 y a la beta‑2‑microglobulina de los antígenos clase I, mientras que los dos dominios distales (alfa-1 y beta-1) de los antígenos clase II se corresponden con los dominios alfa-1 y alfa-2 de la molécula clase I. La hendidura donde se ubica el péptido se forma entre los dominios alfa-1 y beta-1 de las moléculas clase II.

Distribución tisular de las moléculas clase I y II.    

Las moléculas de clase I se encuentran presentes en la mayoría de las células nucleares del organismo pero no en todas, dado que, en algunas localizaciones, su expresión es mínima o incluso nula, como sucede en el endotelio, glándulas de Brunner duodena­les, trofoblasto velloso o neuronas del sistema nervioso central.

La expresión de las moléculas de clase II se encuentra funda­mentalmente restringida a macrófagos, monocitos, linfocitos  B y cuando están activados también en linfocitos T y NK. Igualmente se encuentra expresado en alta densidad en otras células que actúan como presentadoras de antígenos, tales como células dendríticas del bazo, epidérmicas de Langerhans o células endoteliales. También se encuentran en progenitores hematopoyéticos, células leucémicas y células de diferentes tipos de tumores.

Esta distribución diferencial de las moléculas de histocom­patibilidad de clase I y II se encuentra directamente relacionada con la diferente función de cada tipo de moléculas. Los niveles relativos de las moléculas HLA en diferentes órganos y tejidos es muy variado (Figura 5.5).

 Otras moléculas de histocompatibilidad

Existen otras moléculas de histocompatibilidad entre las que destacan de manera más significativa: HLA-G, HLA-E y HLA-F, que presentan una gran homología con las moléculas clásicas de MHC de clase I (HLA-A, -B y -C). 

·                    HLA-E: La estructura tridimensional de la molécula de HLA-E, es muy similar a la de las moléculas clásicas HLA-A, B y C presentando sitios de unión conservados para la b-2-microglobulina y al CD8. Esta molécula, cuando presenta  el péptido adecuado, se une a los  receptores CD94/NKG2A que inhiben la actividad citotóxica de las NK y ciertos linfocitos T. En la actualidad se ha descubierto que la proteína UL40 presente en los citomegalovirus, es capaz de  unirse ella, y provocar una cascada de inhibición en las células NK. 

·                    HLA- F: Se sabe que esta molécula se expresa principalmente en amígdalas, bazo y timo. La localización de la proteína es intracelular. Además, está descrito que los tetrámeros de HLA-F se unen a los receptores ILTR2 (LIR1) y ILTR4 (LIR2) que son receptores inhibidores de leucocitos.  

·                    HLA-G: La molécula HLA-G pertenece a la familia de moléculas de histocompatibilidad no clásicas y se caracterizan por un limitado polimorfismo y una distribución celular y tisular restringida al trofoblasto fetal y células del epitelio tímico. Esta molécula puede presentarse en siete isoformas distintas, codificadas por splicing alternativo, cuatro de ellas son proteínas unidas a membrana  (HLA-G1, G2, G3 Y G4), y otras tres isoformas que son proteínas solubles (HLA-G5, G6 Y G7). Otras características de esta molécula son:

·         Es reconocida por ciertos receptores inhibidores, tales como KIR2DL4, ILT-2 y ILT-4 y, en consecuencia posee, capacidad de inhibir la lisis mediada por células NK y ciertas células T.

·         Está relacionada con la inducción de tolerancia materno-fetal. Se ha demostrado que la molécula HLA-G es capaz de inhibir la actividad de las células NK de los leucocitos de la decídua sobre los trofoblastos durante el primer trimestre de gestación

·         Parece participar en la vigilancia del sistema inmune frente a tumores y se ha descubierto un aumento en el nivel de la expresión de esta molécula en la superficie de las células infectadas por el HIV, que podría ser una forma del virus de escapar de la destrucción por el sistema inmune.

Familia de moléculas CD1. Los antígenos CD1 son glicoproteínas no polimórficas constituídos por una cadena pesada de 43-49 kDa que, en muchos casos, se asocia con la beta-2-microglobulina (beta-2-m). Se ha definido como una molécula presentadora de antígeno presente en la mayoría de los mamíferos encontrándose tanto en las células dendríticas como en timocitos. Mientras que en ratones las moléculas CD1 pueden presentar péptidos y moléculas no peptídicas como glicolípidos a células T, en humanos sólo hay evidencia de presentación de antígenos no peptídicos de origen microbiano, generalmente a células T de TCR restringido Las células T implicadas en el reconocimiento de antígeno presentado por CD1 son denominadas NKT.

En humanos la familia de los genes de CD1 contiene 5 miembros: CD1A, CD1B, CD1C, CD1D y CD1E, que se agrupan en dos grupos en base a la similitud de la secuencia de aminoácidos entre ellas y entre especies. En general, las moléculas de CD1 se expresan predominantemente en timocitos y en algunas APCs derivadas de médula ósea como las células dendríticas. Se ha descrito que las células del epitelio intestinal expresan las moléculas de CD1d.

GENÉTICA DEL COMPLEJO MAYOR DE HISTOCOMPATIBILIDAD    

Como ya se ha dicho, los genes que codifican las moléculas cuya estructura y función hemos estudiado, se encuentran agrupa­dos en el genoma formando el Complejo Mayor de Histocompatibilidad que se extiende aproximadamente 2-3 centimorgans (aproximadamente 4x106 pares de bases) y en el humano contiene al menos 50 genes distintos. Este grupo de genes se encuentra organizado de forma dife­rente en las distintas especies, conociéndose con precisión la organización genética del MHC en el hombre, sistema HLA, y el ratón, sistema H‑2. Recientemente se ha propuesto una nueva taxonomía para clasificar  los distintos genes  que codifican las moléculas de histocompatibidad, (Tabla 5.2) 

Complejo Mayor de Histocompatibilidad en el hombre.   

El Complejo Mayor de Histocompatibilidad en el hombre está constituido por un grupo de genes situado en el brazo corto del cromosoma 6. El complejo mayor de histocompatibilidad humano es donde se codifican los loci que de los distintos antígenos HLA clase I y II (Figura 5.6).  Entre los de  clase I se encuentran los genes que codifican las cadenas a de los antígenos HLA‑A, HLA‑B y HLA‑C y entre los de clase II se encuentran los pares de genes que codifican las cadenas alfa y beta de los antígenos  HLA‑DR, HLA‑DQ y HLA‑DP.

Este grupo de genes se heredan de acuerdo con las leyes de Mendel, como caracteres codominantes simples. La región genética de un cromosoma que contiene todos los genes HLA (a excepción de los que codifican la beta‑2‑microglobulina) se denomina haplotipo HLA (Figura 5.7). Así pues un haplotipo HLA incluye los genes clase I: HLA‑A, HLA‑B y HLA‑C y los genes clase II: HLA‑DR, HLA‑DQ y HLA‑ DP. y otros loci que codifican moléculas implicadas en el procesamiento de péptidos como son los genes TAP cuyos productos están implicados en la transferencia de péptidos del citosol al retículo endoplásmico y los genes LMP que codifican componentes del proteosoma responsable de transformar proteínas en péptidos que posteriormente serán presentados en la superficie celular. Asimismo en esta región se encuentran los genes que codifican algunos factores del complemento, la enzima 21‑hidroxilasa, la citocina TNF-alfa y otros genes y pseudogenes con homología estructural con los genes clase I y clase II con limitado polimorfismo y cuya función aun se encuentra insuficientemente aclarada (Figura 5.8).

La existencia de estos diferentes loci fue demostrada inicialmente por la aparición espontánea de recombinaciones entre los mismos o la existencia de líneas celulares mutantes, con pérdidas de uno o varios loci y ha sido confirmada a lo largo de los últimos años por el empleo de técnicas de biología molecular que han permitido aislar y secuenciar estos genes. Gracias a estas técnicas de biología molecular se ha descubierto la existencia en esta región de numerosos genes y pseudogenes pero solamente una minoría tienen estructura clase I o clase II mientras que la mayoría no están relacionados estructuralmente.

Cada célula del organismo, (excepto las células germinales), poseen un haplotipo procedente del padre y otro de la madre.  La mayoría de los genes del MHC son altamente polimórficos, es decir pueden ser estructuralmente diferentes entre individuos de la misma especie. No obstante, como se vio al hablar de la estructura, existen zonas muy conservadas, prácticamente idénticas en todos los individuos y zonas altamente variables.

Cada especificidad definida en la superficie celular repre­sentaría un alelo diferente a nivel genómico. Como se muestra en la tabla 5.3, se han descrito numerosos alelos para los diferentes loci HLA. Dado que cada individuo posee dos de cada uno de estos alelos, el número de combinaciones teóricas posibles en la población considerada en su conjunto es muy alto.

A menudo se describen nuevas especificidades asociadas a otras previamente establecidas. Estas nuevas especificidades se suelen denominar especificidades subtípicas  que aparecen por división de otras anteriores y a las antiguas especificidades supertípicas. Así por ejemplo, las especificidades HLA‑B51 y HLA‑B52 se consideran como productos de la división del antígeno HLA‑B5. De hecho la secuenciación de los genes HLA ha demostrado que el polimorfismo que es detectado a nivel serológico es sólo una parte del que se encuentra a nivel genómico. Así por ejemplo existen numerosos subtipos de HLA‑A2 y numerosos subtipos de HLA‑B27. Ello ha hecho que se establezca un nuevo sistema de nomenclatura para los diferentes alelos HLA que utiliza la letra del loci seguida de 4 dígitos tal como se muestra en el Apéndice. Los dos primeros dígitos serían los de la especificidad serológica y los otros dos indicarían la especificidad detectada por secuenciación.

Los haplotipos heredados de cada padre van a determinar el genotipo del hijo, es decir, el genotipo de éste será la suma de un haplotipo procedente de padre y otro procedente de la madre. En la Figura 5.9 se ilustra gráficamente todo lo anterior­mente expuesto.  En una familia determinada en la que el padre tiene los haplotipos (a) = A2, B8, Cw1, DR1 y (b) = A3, B7, Cw3, DR4 y la madre los haplotipos (c) = A2, B7, Cw2, DR2 y (d) = A11, B13, Cw3, DR5 los hijos podrán heredar cuatro combinaciones distintas de estos haplotipos, siendo (a,b), (b,c) y (b,d) los posibles genotipos resultantes.

Tras la secuenciación completa del Complejo Mayor de Histocompatibilidad en el 1999 se conoce que esta región la forman más de 200 loci, muchos de los cuales aún son funcionalmente desconocidos, aunque posiblemente la mitad juegue un papel en la función del sistema inmune. Probablemente el estudio del polimorfismo de esta región ayudará a comprender por qué unas personas desarrollan unas enfermedades y otras no, en todo caso este avance será una importante herramienta para el estudio filogenético, la biología y la evolución de las familias de multigenes, las poblaciones y la enfermedad. 

Loci  HLA‑A, B, C. 

La región que codifica las moléculas de clase I está dividi­da en tres loci, conocidos como A, B y C, que codifican tres tipos de cadenas pesadas para las distintas moléculas de clase I. Algunos de estos genes han sido estudiados me­diante técnicas de hibridación de DNA y se ha demostrado que se encuentran divididos en exones e intrones, encontrándose una estructuración homóloga a los genes que codifican la b‑2 microglobulina, las inmunoglobulinas y otros tipos de proteínas.

El prototipo de gen que codifica moléculas de clase I, se encuentra dividido en 8 exones, cada uno de los cuales, se co­rresponde a cada dominio estructural de la molécula. Si bien se conoce con precisión la función de estas tres familias de antígenos de histocompatibilidad de clase I expresados en la superficie celular, se ha demostrado la existencia de otros genes que también codifican otros antígenos HLA de clase I con menor polimorfismo y cuya expresión es variable, tanto en su distribución tisular como en la densidad en la membrana celular. Entre estos genes se incluyen: HLA‑E, HLA‑F y HLA‑G.

·              Gen HLA-E:  Este gen presenta una secuencia parecida a la molécula Qa1 murina, que une péptidos hidrofílicos de la secuencia leader de las moléculas MHC clásicas. Se expresa en pequeñas cantidades en la superficie de la célula, y su expresión está regulada por la presencia de las otras moléculas de histocompatibilidad presentadas en la superficie celular y es TAP dependiente.  

·              Gen HLA- F: Este gen es muy similar en estructura y secuencia a los genes de las moléculas clásicas. Se trancribe en una gran variedad de células y tejidos presentando un polimorfismo limitado.

·              Gen HLA-G: Este gen presenta la estructura típica de la HLA clase I y su expresión parece estar restringida a la placenta y se asocia con funciones de caracter tolerogénico..

Región HLA‑D 

En la región D se localizan los genes que codifican las moléculas HLA‑DR, HLA‑DQ y HLA‑DP. Su análisis bioquímico demuestra que se trata de moléculas de clase II compuestas, como ya hemos indicado, por una cadena a y otra b.

 Las moléculas HLA‑DR y HLA‑DQ se estudiaron por serología y los antígenos HLA‑DP fueron inicialmente definidos por estudios funcionales, mediante estimulación secundaria de linfo­citos previamente sensibilizados (PLT).

El empleo de técnicas de biología molecular han permitido el aislamiento y secuenciación de los genes de esta región, de manera que hoy se conoce con precisión que la región D posee un elevado número de genes.

Los genes de la familia DR comprenden un gen DRA que codifica la cadena DRalfa y posee escaso polimorfismo y al menos cuatro genes DRB (DRB1, 3, 4, 5) que codifican cadenas DRbeta que contienen gran polimorfismo. Se han descrito otra serie de pseudogenes DRB (DRB2, 6, 8) sin conocerse aún su función y expresión. La cadena proteica DRalfa puede combinarse (Figura 5.10).  con las diferentes cadenas beta codificadas por los genes DRB dando origen a las moléculas de clase II portadoras de las especificidades HLA‑DR (la unión de los productos de los genes HLA-DRA y HLA-DRB1 y las especificidades HLA‑DRw51, 52 y 53 (la unión de los productos de los genes HLA-DRA y HLA-DRB5, DRB3 o DRB4, respectivamente).

Tanto las familias DQ como DP contienen dos pares de genes, es decir dos genes a y dos genes b, próximos entre sí y todos polimórficos. Sólo uno de estos pares, DQA1 y DQB1 y DPA1 y DPB1, codifican las cadenas a y b de las moléculas de clase II HLA‑DQ y HLA‑DP respectivamente. Los otros 2 pares de genes DQA2, DQB2 y DQB3 (pseudogen) y DPA2 y DPB2 poseen un limitado polimorfismo y no se encuentran expresados en la superficie celular. Además existe otra subregión que contiene un gen a, denominado DNA, y un gen beta, DOB, que podrían codificar un nuevo tipo de moléculas clase II.

Por otra parte también se han localizado una nueva pareja de genes, HLA-DM, no polimórficos, que se encuentran implicados en el proceso de procesamiento y presentación de antígeno como se expone en el próximo capítulo. Cada uno de estos genes esta estructurado en secuencias de intrones y exones  relacionados con los dominios estructurales de la proteína codificada por ellos. 

Tipaje HLA. 

Se denomina tipaje HLA, al análisis llevado a cabo en el laboratorio para conocer los alelos HLA de un determinado individuo  mediante métodos serológicos, análisis de genes por biología molecular (Figura 5.11).  y métodos celulares.  

El tipaje HLA tiene especial interés en las siguientes situaciones: 

·         Estudio de la asociación con distintas formas clínicas de una enfermedad. Por ejemplo la diabetes insulino-dependiente está asociada a DR3 y DR4 y

·         En trasplantes de órganos y medula ósea y

·         Estudios de filiación familiar.

La mayoría de los genes del HLA son altamente polimórficos, como ya se explicó en el apartado anterior, y cada especificidad definida en la superficie celular representaría un alelo diferente a nivel genómico. Así se han descrito numerosos alelos para los diferentes loci HLA.

Método Serológico. 

El método serológico más comúnmente utilizado es el test de microlinfocitotoxicidad, que se realiza enfrentando una población de linfocitos a una batería de sueros o anticuerpos monoclonales que son específicos para cada uno de los antígenos posibles. Posteriormente se añade complemento de tal manera que en los pocillos en los que se encuentre el antisuero específico para los antígenos de un individuo determinado, se producirá la lisis celular que podrá ser visualizada al microscopio. Para visualizar la lisis, actualmente se usan una técnica fluorescente con una mezcla de anaranjado de acridina y bromuro de etidio. El bromuro de etidio se fija al ADN de las células muertas (que aparecen de color rojo) y desplaza al anaranjado  de acridina que tiñe a las células vivas de color verde brillante. Los cultivos se incuban y se hacen las lecturas de viabilidad celular (Figura 5.12). .

Para llevar a cabo la tipificación de los antígenos de clase II se utilizan poblaciones purificadas de linfocitos B, ya que en estas células los antígenos de clase II se expresan más abundantemente que en los linfocitos T (de hecho, las células T expresan cantidades significativas de moléculas MHC de clase II sólo cuando están activadas). Los linfocitos B se separan haciendo pasar suspensiones de lin­focitos totales a través de una columna empaquetada con fibra de nylon. Por sus propiedades adherentes, las células B se retienen en el nylon y posteriormente se despegan por manipulación mecánica de la columna de la que previamente se han elimina­do, por lavado, las células no adherentes. Existe a su vez, otro método más utilizado y menos perjudicial para la separación de las células B que consiste en el uso de microesferas magnéticas acopladas a anticuerpos contra antígenos específicos de estas células (el antígeno CD19, por ejemplo). La sangre se mezcla con las esferas y luego éstas se separan en un campo magnético (con un imán) y se lavan para proceder a su tipificación por serología. 

Métodos de Biología Molecular: 

Las técnicas de biología molecular más usadas (no las únicas) para detectar polimorfismos en el ADN utilizan los métodos de:

a.    Secuenciación directa del ADN.

b.   Análisis del tamaño de los fragmentos de restricción del ADN (RFLP restriction   fragment lenght polymorphism).

c.    Reacción en cadena de la ADN polimerasa (PCR, polymerase chain reaction). 

La secuenciación directa del ADN no es práctica para su uso rutinario. Actualmente son utilizadas técnicas de PCR-SBT en la que se secuencian los fragmentos amplificados mediante PCR.

La técnica de RFLP incluye la fragmentación del ADN con enzimas de restricción, la separación electroforética de los fragmentos, la transferencia de los fragmentos separados a membranas de nylon, la hibrida­ción con sondas, de secuencias conocidas, marcadas con isótopos radiactivos o con enzimas y la detección del producto por autorradiografía, quimioluminescencia o colorimetría. La técnica de PCR permite amplificar segmentos particulares de ADN en pocas horas (ver capitulo sobre métodos inmunológicos).

Las técnicas que actualmente más se utilizan para realizar tipaje HLA son PCR-SSO y PCR-SSP. La PCR-SSO (Figura 5.13).  que se basa en: amplificación de la zona polimórfica del ADN por PCR, hibridación con oligonucleótidos específicos de secuencia (SSO) fijados a membranas de nylon. Con la técnica de PCR-SSP (Primers específicos de secuencia) sólo se consigue amplificación en aquellas muestras en las que los primers reconozcan el alelo para los que son específicos por lo tanto lo único que se hace es probar la existencia o no de los productos amplificados. 

Métodos Celulares 

También existe la posibilidad de detectar los antígenos de histocompatibilidad por métodos celulares mediante el cultivo de mezclas de linfocitos, del donante y del receptor. Esta reacción que se conoce como  CML (cultivo mixto de linfocitos), se basa en la propiedad que tienen los linfocitos de proliferar cuando se incuban en presencia de linfocitos portadores de antígenos HLA diferentes. Los linfocitos con antígenos idénti­cos no estimulan las respuestas proliferativas entre ellos. La proliferación ce­lular se puede cuantificar utilizando diferentes técnicas, aunque la más común mide la incorporación de timidina tritiada (3HT) por las células proliferantes. En una variante de la reacción, denominada CML unidireccional, las células estimuladoras se tratan previamente con mitomicina C para inhibir su capacidad de división celular, sin modificar su viabilidad (la mitomicina se combina con los husos cromáticos evitando la segregación cromosómica y la mitosis) y así las célu­las sólo funcionan como antígeno. Los cultivos de células mezcladas se mantienen de 72 a 96 h antes de adicionar la timidina radiactiva. De 4 a 18 horas después las células se colectan, se lavan y se procesan para determinar la cantidad de radiactividad incorpora­da. La incorporación de 3HT se establece midiendo la emisión de radiación beta en un contador de centelleo y los resultados se expresan como cuentas por minuto (cpm). 

Regulación de la expresión de los genes del MHC 

En la parte 5' no traducida de los genes se encuentran las áreas reguladoras (llamadas elementos cis) constituidas por el promotor (área estrictamente necesaria) y los aumentadores e inhibidores que modulan la expresión basal de los genes. El promotor suele estar situado a una distancia de unas 300 bases desde el inicio de la transcripción, mientras que los aumentadores o inhibidores se encuentran a distancias variables. Sobre estas áreas cis se fijan unas proteínas llamadas factores de transcripción (elementos trans) que son necesarios para que se active la polimerasa II, enzima que inicia la transcripción. En muchos casos, la inducción de la expresión de los genes se debe a modificaciones post-transtraducionales de estas proteínas como son la fosforilación o la glicosilación. Hasta ahora no se conoce el mecanismo exacto de la expresión de los genes de clase I y II aunque se han descrito algunos de sus elementos cis y trans.

Los genes de clase I y beta-2-microglobulina tienen regiones cis muy parecidas y su expresión esta coordinada. Se han detectado tres regiones cis en el promotor a las que se unen factores de transcripción y que se llaman aumentadores A y B y entre ellos el IRE (elemento de respuesta al interferón) (Figura 5.14). Además, existen dos inhibidores en dos regiones a unas -700 y -400 bases. Sobre las áreas cis se unen factores de transcripción que no son específicos del promotor de clase I, sino que regulan muchos genes. En la región I del aumentador A se une RXRb que es un elemento de la familia de los receptores de la hormona tiroidea y del ácido retinoico y que se une a AP-1 (Proteína Activadora 1)  que es un complejo de los oncogenes jun y fos originando un heterodímero que aumenta su afinidad por el DNA. En la región II del aumentador A se une el NF-kB (Nuclear Factor-kB). En la región IRF se unen proteínas que se inducen por efecto del interferón y que se fosforilan por una tirosina quinasa. Por último, en el aumentador B parece que se unen proteínas del grupo AP-1 que responde a la inducción con AMP cíclico.

En el promotor de todos los genes de clase II y de todas la especies descritas, existen tres áreas con secuencias que tienen una gran homología entre los genes y que se denomina X, Y y W separadas entre si por  unas 20 bases. Estas áreas son esenciales para la transcripción (elementos cis) y sobre ellas se unen una serie de factores de transcripción. La caja Y contiene una secuencia CCAAT sobre la que se une el NFY (Nuclear Factor Y) compuesto por dos proteínas A y B, ambas se requieren para una unión eficiente al DNA. Sobre la caja W se une un factor no caracterizado hasta ahora y sobre la caja X, dependiendo del extremo 5'(X1) se han descrito proteínas RF-X y NF-X y sobre el extremo 3'(X2) se unen hXBP y el complejo AP-1 (fos-jun) aunque estas interacciones con el DNA no están muy claras. La distancia crítica que separa estas cajas sugiere que los factores de transcripción que se unen a ellas interaccionan dando lugar a que se inicie la transcripción. Sin embargo, no sabemos que es lo que hace que se induzca clase II por efecto del gamma-interferón  o porque en algunos casos la inducción de clase II sea constitutiva. 

Otros genes del sistema HLA. 

Situados en el complejo HLA se encuentran un grupo de genes que codifican tanto el componente Bf de la cascada alternativa del complemento, como los componentes de la vía clásica C2 y C4 que se estudian en el capítulo dedicado al complemtno.

Otros genes de esta región y de interés en la respuesta inmune son los genes que codifican

1.      las formas alfa y beta del factor de necrosis tumoral (TNF-alfa).

2.      HSP (Heat Shock Protein).

3.      lmp que codifican los componentes del proteosoma y

4.      TAP1 y 2 que son proteínas transportadoras.  

Estas estructuras como veremos en el capítulo 6, poseen una gran importancia en la función de procesamiento antigénico asociada a las moléculas del MHC. También dentro del sistema HLA e íntimamente relacionado con los genes anteriores, se encuentran los genes que codifican la enzima 21‑hidroxilasa, que participa en el metabolismo de ciertas  hormonas sexuales. 

Complejo Mayor de Histocompatibilidad en el ratón.   

El complejo mayor de histocompatibilidad en el ratón (sistema H-2) se ha llegado a  conocer después de diversos procesos de recombinación genética de ratones hasta la obtención de cepas recombiantes (Figura 5.15). Se localiza en el brazo corto del cromosoma 17 e incluye varios loci, entre ellos los K, IA, IE, S y D. Como en el humano, cada locus contiene uno de varios genes alternativos. Los genes K y D codifican para los antígenos de clase- I (K y D), equivalentes a los humanos  HLA- A y HLA-B. Los loci IA e IE (análogos a los antígenos D en el humano) contienen a los genes Aa/Ab y Ea/Eb que codifican a los antígenos MHC de clase III (Ia e Ie). Dentro del complejo H-2 también está insertada una región S donde se encuentran los genes correspondientes a los antígenos de clase III (C2 y C4). Como en el humano, los genes H-2 se heredan en bloque (como haplotipos), son codominantes y se segregan siguiendo las leyes de Mendel (Figura 5.16).

En la tabla 5.4 se muestran los distintos haplotipos H-2 de las cepas murinas mas comunes y en la figura 5.17.  se compara la organización del complejo de histocompatibilidad murino con los de las diferentes especies.

MECANISMOS DE GENERACION DEL POLIMORFISMO

El polimorfismo del MHC es el resultado de un largo proceso de evolución a lo largo de miles de millones de años como consecuencia de la presión evolutiva ejercida por los agentes infecciosos. Para la generación de este elevado polimorfismo el MHC ha utilizado diferentes mecanismos que han contribuido de diferente forma a la creación de nuevos alelos. Así, algunos son el resultado de mutaciones puntuales mientras que otros proceden de la combinación de secuencias completas entre diferentes alelos, bien mediante un proceso de recombinación génica o bien mediante el proceso denominado conversión génica, según el cual una secuencia es reemplazada por otra semejante de un gen homólogo. La recombinación entre alelos del mismo locus parece ser el mecanismo más frecuentemente utilizado para la creación del polimorfismo y así muchos alelos diferentes pueden proceder de procesos de recombinación repetidos a partir de un pequeño número de genes ancestrales. La existencia de este proceso evolutivo apoya que el polimorfismo es esencial para la función de los antígenos de histocompatibilidad.  

FUNCION MOLECULAS DE HISTOCOMPATIBILIDAD   

Las moléculas de histocompatibilidad  presentes en las células del organismo son marcadores para las células del sistema inmunitario de "lo propio" (el yo inmunológico) e intervienen de manera fundamental en la educación tímica de los linfocitos T (Tabla 5.5).

La función biológica de las  moléculas de histocompatibilidad es la de presentar péptidos antigénicos para la activación de los linfocitos T. Los linfocitos T que reconocen moléculas HLA  clase I y su péptido pertenecen a la subpoblación citotóxica. Las células T que reconocen moléculas HLA clase II en su la mayoría tienen función reguladora produciendo citocinas. Las moléculas de histocompatibilidad de un individuo son antigénicas para otro y por lo tanto activan el sistema inmune (rechazo de trasplantes).

 HLA Y ENFERMEDAD   

Desde hace varias décadas se sabe que el padecimiento de ciertas enfermedades se asocia con el incremento en la frecuencia de un determinado alelo HLA. Esta asociación cuando tiene un valor estadísticamente significativo, se viene considerando  como un factor de susceptibilidad o un marcador de riesgo a padecer la enfermedad, que puede cifrarse estadísticamente como “riesgo relativo” (RR) y da una idea de la mayor o menor probabilidad que tiene un sujeto  a padecer una determinada enfermedad si presenta dicho marcador o alelo HLA con respecto a aquellos individuos que no lo tienen.  

Efectivamente, a pesar del gran polimorfismo de las moléculas HLA y de la ampliación del número de subtipos alélicos de clase I y de clase II, hoy  se conocen múltiples enfermedades que  están asociadas a clase I  y otras a clase II (Tabla 5.6). El número de enfermedades asociadas a alelos de clase I es menor que el de las asociadas a clase II.

Las causas de esta asociación HLA y enfermedad no es conocida completamente. Por ejemplo en espondilitis anquilopoyética (EA), enfermedad  invalidante y que afecta a las articulaciones de la columna principalmente, y en la que se ha descrito una fuerte asociación con HLA-B27, se ha podido observar que ciertos  péptidos antigénicos de origen articular serian capaces de formar un complejo con HLA-B27 específicamente que induciría fenómenos de autoinmunidad, bien por generar en la molécula B-27 modificaciones conformacionales  que la harían no ser reconocida como propia, bien por generar complejos HLA-péptido con cierta similitud con antígenos bacterianos que provocarían reacciones cruzadas autoagresivas en individuos HLA-B27, previamente sensibilizados a tales antígenos bacterianos.

En el caso de la diabetes mellitus insulin dependiente (DMID), enfermedad que cursa con una destrucción selectiva de los islotes de Langerhans del páncreas, con infiltración linfocitaria, se considera que es el resultado de una respuesta autoagresiva frente a antígenos presentes en la membrana celular mediada por linfocitos T.

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