Tema 7. Transcriptómica

1. Análisis de la expresión génica a nivel de transcrito.
2. Procesado y anotación masiva de secuencias (Blast2Go).
3. Análisis mediante microarrays.
4. Análisis mediante RNA-Seq.
5. Aproximaciones al estudio del ARN no codificante (ncRNA).
6. Small RNA.
7. Generación, uso y aplicaciones del miRNA.

1. Análisis de la expresión génica a nivel de transcrito

• Análisis individual de la expresión de transcrito
• Análisis SAGE (Serial Analysis of Gene Expression) (desarrollada por el Dr. Velculescu)
  • Wikipedia sobre SAGE
  • Un protocolo detallado para realizar un experimento SAGE

2. Procesado y anotación masiva de secuencias

• EGAssembler, un servidor simple y útil para la manipulación y ensamblado de secuencias, incluyendo las librerías de EST que usa el ensamblador CAP3
• La página del programa Blast2Go para la anotación masiva de genes

3. Análisis mediante microarrays

• Introducción a los microarrays
• La empresa Affymetrix, lider en el desarrollo de microarrays
  • Recursos educacionales de Affymetrix
  • Presentacion e introducción a los microarrays (**)
  • Normalización de datos en el microarray
• La empresa Agilent
  • Los servicios de microarrays de Agilent
• Programas depositados en Bioconductor que funcionan en la plataforma R
  • El paquete Affy
  • El paquete limma
  • La utilidad GEO2R del NCBI (para generar código automáticamente con código R)
  • El programa RMA Express capaz de analizar datos de Affymetrix
• Métodos estadísticos para valorar la expresión diferencial de genes
• Un pequeño repaso de bioestatística..
• El paquete SVC de R que elimina efectos de batch. Inlcuye ahora Combat, un sistema para analizar biases en los análisis de microarray
• Clasificación y clustering
• El conjunto de programas BRB-Array
  • Un documento pdf ejemplo de cómo se usa BRB-Array
• Un ejemplo de cómo analizar Datos de Microarray con R y Bioconductor aplicado a la leucemia mieloide
• Curso para estudiantes de los análisis de microarrays con GeneChip de Affymetrix
• La suite MeV para el análisis de microarrays (y RNA-Seq)

• Tutorial de microarrays con R y GeoQuery
• Heatmaps con R
• Bioconductor Workflows, una cantidad ingente de tutoriales de gran interés (***)
• Cursos de microarray publicados en Internet
• Información sobre los microarrays proporcionada por el NCBI

4. Análisis mediante RNA-Seq

• Introducción al RNA-Seq
  • ¿ RNA-Seq o microarrays ?. Ventajas e incovenientes. Lee la discusión de este artículo que lo indica
  • Un PDF que explica conceptos importantes en RNA-Seq
• El problema del rRNA.
  • Cómo y por qué purificar el poli(A) de eucariotas
  • Como eliminar el rRNA con RiboZero tanto en eucariotas como en procariotas (artículo)
• Cómo trabajar con las cadenas sentido y antisentido (info)
• Bibliotecas Stranded vs non-stranded en el RNA-seq
  • Un hilo del foro de Biostar que explica por qué es mejor usar librerías stranded

Programas y servicios diseñados para el análisis mediante RNA-Seq

A) Servicios desde donde se pueden obtener genomas de referencias

• Biomart. Una base de datos desde donde puede obtenerse una cantidad ingente de datos de los genomas
• Phytozome. Otro portal desde donde puede obtenerse datos a partir de los genomas
• Base de datos SRA del NCBI (almacena datos y alineamientos de secuencias obtenidas mediante sistemas NGS) ya sean genomas como transcriptomas
• La base de datos ENA del EBI

B) Bases de datos desde donde se pueden obtener datos para aprender a procesar los datos

• Base de datos GEO (Gen Expression Omnibus). Contiene datos de microarrays y RNA-Seq disponibles publicamente
• Base de datos Experimentdata de Bioconductor.org

C) Programas que son capaces de mapear las lecturas de RNA a un genoma de referencia capaces o no de procesar el splicing

• Mapeadores que no reconocen el splicing (útil para organismos procariotas)
  • bowtie y bowtie2
  • BWA
  • MAC
• Mapeadores que reconocen y permiten el mapeo de lecturas considerando el splicing
  • Kallisto. Un nuevo programa que hace pseudoalineamientos..
    • Un tutorial para usar Kallisto dentro de R
  • TopHat, que usa el ensamblador Bowtie. Un clásico. Este programa se puede usar con Cufflinks
    • Tutorial de como usar TopHat
  • HISAT. Un sucesor de TopHat para el alineamiento de lecturas de RNA-Seq
  • STAR, un programa en auge de mapeo extremadamente rápido
  • Sailfish

 

D) Programas que son capaces de determinar el "conteo" de las lecturas a los genes una vez que se han mapeado a un genoma de referencia

• Qué es RPKM, FPKM y TPM (métodos para la normalización de datos)
• HTSeq-count. Aporta datos crudos, sin normalización
• simpleRNASeq, una función incluida en el paquete R easyRNASeq
• summarizeOverlaps, una función incluida en el paquete R GenomicAligments

E) Información y Tutoriales para filtrar los datos obtenidos de archivos SAM/BAM

• http://bpbio.blogspot.com.es/2010/09/filtering-paired-end-reads-high.html
• SAMTOOLS tutorial, por BioBits
• Cómo averiguar el tamaño de los insertos desde archivos BAM/SAM
• Otro modo de averiguar el tamaño de los insertos

F) Programas que analizan la expresión diferencial de genes con el RNA-Seq

• Paquetes que funcionan bajo R depositados en Bioconductor (solo se mencionan los más conocidos)
  • Bioconductor DESeq2 (nueva versión del programa)
    • Un tutorial de cómo se usa DESeq2
    • Otro tutorial de como se usa DESeq2
  • Bioconductor BitSeq (funciona desde archivos SAM/BAM)
  • Bioconductor edgeR
  • El código RNASeqGUI, un programa que contiene un GUI (graphical User interface) para trabajar con RNA-Seq y R (***)
  • Bioconductor baySeq (analiza datos conforme métodos Bayesianos empíricos)
  • easyRNAseq, un programa para analizar los datos mediante R y bioconductor
  • Manual de referencia de easyRNAseq
  • Un tutorial de RNA-Seq con bioconductor
• Programas independientes del paquete estadístico R
  • Cufflinks: un programa clásico muy utilizado con TopHat. Se trata de ensamblador de transcriptoma y un estimador de abundancia de de transcritos para análisis de RNA-Seq que normaliza los datos de conteo. Se puede usar con Cuffmerge (para obtener un ensamblado transcriptómico), Cuffdiff (para ver la expresión diferencial) y CummeRbund (para ver representado los datos). Representa uno de los pocos casos en los que se puede analizar el RNA-Seq sin usar R
    • Tutorial para Cufflinks

G) Programas que analizan ayustamientos, límites y reorganizaciones de genes

• Trans-ABySS, un ensamblador para transcriptoma con secuencias cortas
• SOAPsplice, un ensamblador que funciona bajo Linux con secuencias Illumina
  • El trabajo original de SOAPsplice que puede verse con ReadCube

H) Programas capaces de ensamblar y generar transcriptomas

• StringTie
• Trinity

I) Programas para analizar los datos procesados por los ensambladores

• UCSC Genome Browser
• IGV (Integrative Genome Browser)
• IGB (Integrated Genome Browser)
• Artemis. Como todo muestra los mapeos con un genoma de referencia, Artemis se puede usar para el análisis de RNA-Seq
  • Página con demostraciones de Artemis (descargar el ejemplo Plasmodium falciparum 3D7)
  • Trabajo publicado sobre el análisis del caso anterior
• SeqMonk, un programa para analizar datos RNA-seq. (JAVA)
  • Serie de vídeos para aprender a usar SeqMonk (***)
  • Vídeo Youtube usando este programa

• GeneScissors, un programa que trata de arreglar los mal alineamientos realizados con RNA-seq
• Trinity, un programa para el ensamblado trasnscriptómico de RNA-seq en proyectos que no contengan las secuencias del genoma de referencia (realiza un transcriptoma de novo con secuencias transcriptómicas)

J) Soluciones integradas y multiplataformas para RNA-Seq y otras utilidades

• Servidores Galaxy (***) (se trata del mismo servidor pero en instituciones diferentes)
  • El servidor Galaxy/Rät
  • El servidor useGalaxy
• El programa comercial GeneSpring GX (caro y que exige suscripcion anual de pago)
• GenePattern, un programa en JAVA que posee cientos de aplicaciones útiles en NGS
• RMA Express (limitado)
• La suite RobiNA, para Mac, Windows y con Java, que usa el paquete R como base (**)

Bibliografía y publicaciones científicas relacionadas con el RNA-Seq

• Un magnifico tutorial que explica los diferentes formatos de archivos (*****)
• Bioconductor Workflows, una cantidad ingente de tutoriales de gran interés (***)
• Un pdf tutorial sobre el RNA-seq del Center for Translational... (***)
• Un trabajo que estudia mediante RNA-Seq casos de cáncer de prostata en la población china
• Vídeo sobre un curso de introducción al RNA-Seq (en portugués)
• Vídeo youtube sobre la estadística aplicada al RNA-Seq (***)
• Página Wiki sobre la suite Galaxy con una enorme cantidad de recursos para poder usarlo (***)
• Manuales de Análisis de RNA-Seq con R y Bioconductor del Institute for Integrative Genome Biology
• Webminars de Pacific Biosciences sobre:
  • Cómo diseñar y preparar muestras de full-leght cDNA con el protocolo Iso-Seq
  • Análisis Bioinformático de la secuenciación con el sistema Iso-Seq
• Un trabajo publicado en Genome Biology que valora programas de análisis de RNA-Seq (2013) (***)
• Un tutorial, RnaSeqTutorial, que funciona bajo R
• Tutoriales de RNA-Seq de Mar González Porta en GitHub (***)
• Una charla Webminar sobre el análisis mediante RNA-seq en YouTube (***)
• Un documento que permite optimizar el uso de R en supercomputadores (***)
• (***) Trabajo que compara varios métodos de normalización de datos
• Un trabajo guía sobre el RNA-Seq en organismo no modelos
• Lista de programas asociados al estudio tipo RNA-seq (***)
• Página con 3 Webminars grabados sobre RNA-Seq
• Un Webminar sobre en análisis de datos en RNA-seq
• Un ejemplo de identificación de RNA en Drosophila
• RNA-seqblog. Un blog con información sobre RNA-seq (***)
• Obtención de datos del UCSC Browser (**)
• Un vídeo introductorio (inglés) sobre el RNA-Seq
• Un magnifico y completo tutorial sobre el RNA-Seq (*****)

5. Aproximaciones al estudio de los RNA no codificantes

• Introducción a los lncRNA.
• Tipos de RNA no codificantes
  • Small RNA
  • lncRNA
• Aproximaciones al estudio de los lncRNA
  • Biotinilación del RNA y CHiP reverso (reverse ChiP)

Más información

• lncBlog. Un blog con información sobre long non coding RNA

6. Small RNA

• Página para la construcción de RNAi del Cancer Genome Anatomy Project
• Acceso al servicio DEQOR v3 (separata)
• Aplicaciones

Más información

• Vídeo sobre los small RNA
• miRNAblog. Un blog con información sobre microRNA