La finalidad de este apartado de las prácticas es múltiple.
- En primer lugar tratamos de convencerle que hay una ingente cantidad de recursos en Internet que puede usar para su propio beneficio. En este caso la existencia tanto de documentos, manuales, kits comerciales con sus protocolos, vídeos explicativos de protocolos y prácticas que son útiles en el área de la Bioquímica y Biología Molecular.
- Se trata de que adquiera el hábito de encontrar y usar estos recursos para conseguir formación autodidacta, sin que tenga que depender de profesorado o terceras personas para ello.
- Para romper el hielo vamos a empezar definiendo un objetivo: que sea capaz de buscar la información necesaria que le permite saber exactamente que ha de hacer para clonar y secuenciar un fragmento de ADN mediante el método Sánger que le proporcionará entre 500 a 1000 bases. En este caso vamos a intentar secuenciar un fragmento de ADN que contenga la secuencia de la insulina humana..
Usando su explorador de Internet y un buscador como Google, Bing (o lo que prefiera) busque:
- Varios protocolos detallados para el aislamiento de ADN a partir de sangre humana.
- Se ha de describir reactivos y el procedimiento completo que le permita de forma efectiva y real aislar el ADN por usted mismo.
- Puede limitarse a incluir el enlace a un documento pdf o una o varias páginas que describa el procedimiento y que contenga detalles de lo que debe hacer (cuanta sangre obtener, cuanto reactivo añadir y cuando, etc, etc)
- Eso si, de poco vale que simplemente encuentre protocolos, así que le voy a pedir que se los lea y que tome la decisión de elegir uno y y que explique por qué lo ha elegido. Si encuentra algún vídeo de YouTube que muestre cómo hacerlo, incluya el enlace en su pagina.
- EVITE protocolos en español, y aquellos en los que se usa un volumen tan elevado de sangre, que exija el uso de una jeringa. Es algo que le va a complicar su trabajo.
- [Opcional] Idem para el aislamiento de ADN a partir de plantas, o de otro tejido humano como células epiteliales humanas.
- Entre en la página del NCBI. En la parte superior izquierda (Search) hay un campo desplegable que le permite seleccionar la base de datos "nucleotide".
- Busque con esta utilidad una de las secuencias de la insulina (insulin). Incluya el número de accesión de dicha secuencia.
- Fíjese en la derecha donde pone Results by taxon / Top Organisms [Tree] porque le dejará seleccionar las insulinas del hombre aplicacando filtros
- También puede usar filtros más completos, como buscando con "human insulin"
- O incluso darle al apartado Advanced que ve justo debajo de donde escribe insulin para poder usar campos como AND, NOT u OR para aplicar con más precisión la búsqueda de términos.
- Cuando ya haya seleccionado el gen de la insulina, es el momento de seleccionar cebadores para el PCR.
- Seleccione una o varias parejas de cebadores que pueda usar para amplificar al menos parte del gen de la insulina usando la opción Pick Primers que ve a la derecha de esa página.
- Indique cuantos intrones tiene el gen que ha seleccionado (atención, el gen completo, no sólo el CDS)
- ¿Qué consideraciones deberíamos tener si el gen tuviera intrones a la hora de querer amplificarlo mediante PCR?
- Busque uno o varias empresas que le permitan pedir cebadores de ADN que pueda usar tanto para la amplificación de su ADN mediante PCR como para la secuenciación.
- Si puede, indique cuál es el precio de un cebador de 25 bases.
- (optativo) Comente los tipos de cebadores que puede pedir a dicha empresa, esto es, los diferentes tipos de modificaciones que puede solicitar para dichos cebadores. Describa alguna de las utilidades de esas modificaciones.
- Busque un método que le permita cuantificar la cantidad (la concentración real) de los oligonucleótidos cebadores que la empresa le pueda proporcionar, o lo que es lo mismo. Que le permita cuantificar la cantidad de ADN que contiene una muestra, ya sea cebadores o ADN genómico. La empresa que fabrica os cebadores normalmente no proporciona la concentración real que le ha suministrado, sino una cantidad aproximada.
- Busque un protocolo de PCR publicado en Internet en el que se indique los componentes, el volumen y cantidad (nmoles, pmoles..) de los tampones y reactivos que le sirva de referencia inicial para tener una idea de cuanto debe usar en cada uno de los tubos para hacer una amplificación mediante PCR.
- Indique las diluciones que ha de hacer cuando reciba un tubo que contiene los cebadores
- Tenga en cuenta la información que ha obtenido del punto anterior, donde se le está indicando cuanta cantidad de reactivos y de cebadores ha de añadir a un tubo para hacer el PCR
- Tenga en cuenta que la empresa que le ha mandado los cebadores, lo habra hecho incluyendo los cebadores en un tubo al que le quepa, como máximo, un volumen de 1,5 a 2 mL (porque el tubo es pequeño)
- Considere también que dicho tubo, para cada uno de los cebadores, suele contener aproximadamente unos 25 nmoles de cebadores liofilizados (esto es, en polvo y sin que haya liquido alguno en el tubo). Esta suele ser la cantidad mínima que la empresa le puede llegar a enviar cuando solicita la síntesis de uno de estos cebadores.
- Tenga en cuenta que estos cebadores vienen liofilizados y que por tanto, debe disolver en el momento de usarlos.
- No estaría mal que buscara información de qué tampón se deberia usar para disolver los cebadores.
- NOTA1. Es seguro que deba hacer una doble dilución porque para alcanzar la dilución requerida en una amplificación de PCR no podrá añadir todo el volumen que necesita porque éste no cabrá en los tubos que le envíen.
- NOTA2: si necesita ayuda para controlar las diluciones, acceda a este documento
- Indique cuantas posibles reacciones de PCR puede llegar a hacer si le envían un total de 25 nmoles de cada uno de los cebadores.
- Se trata de contestar a la pregunta de cuantas reacciones (=cuantos tubos) será capaz de realizar. O cuantos pacientes podria diagnosticar usando una concentración estándar en cada reacción de PCR que ha encontrado en el punto 2. Esto le va a permitir estimar el coste de cada una de las reacciones
- Indique también lo que cuesta en primers hacer una reacción de PCR
- Busque en YouTube un vídeo que muestre como hacer un gel de agarosa. Así aprenderá a hacerlo.
- Busque información de cuál es la concentración de agarosa idónea o requerida para separar de forma adecuada una banda de unas 500 bases
- Busque una empresa que le permita obtener un patrón de tamaño conocido de bandas de ADN para usarlas como control en la electroforesis anterior. La idea es que si espera amplificar una banda de aproximadamente 1000 bases, que tenga una banda control de tamaño conocido que le permita verificar que lo que ha amplificado tiene el tamaño correcto.
- Busque un kit y protocolos y un vídeo en YouTube que le permita aislar una banda de ADN que ha sido separada en un gel de electroforesis de agarosa. La idea es que si aisla una banda de la agarosa (usando una cuchilla) y es capaz de purificar el ADN de esa banda, habrá sido capaz de purificar el ADN y separarlo de los cebadores que había en el tubo.
- Busque en la página WEB del Servicio de Genómica del SCAI de la UCO un manual de secuenciación que le permita saber qué tiene que hacer secuenciar el fragmento de PCR aislado en el punto anterior. Es decir, cómo debe entregar las muestras a un servicio de secuenciación con todo lujo de detalles.
- Indique servicios y/o páginas WEB que permitan:
(limitese a indicar el enlace e incorporar un breve comentario sobre ellos)
- Hacer un mapa de restricción de una secuencia de ADN cualquiera
- Hacer el reverso complementario de una secuencia de ADN cualquiera
- Encontrar palíndromes y/o estructuras secundarias en la cadena de ADN
- Encontrar intrones y exones en las secuencias de ADN
- Encontrar la fase de lectura abierta (ORF) de una secuencia
|