1. Prácticas
que usan la comparación de secuencias a través de matrices
de puntos
(en
la mayor parte de estas comparaciones se recomienda el uso del servidor
Dotlet) |
1. Obtenga la secuencia de
proteína con número de acceso P24014,
que corresponde a una proteína de Drosophila melanogaster.
Realice una comparación de esta secuencia consigo misma, usando
diversas estringencias en las comparaciones usando el programa Dotlet. Verá revelado la presencia de dominios conservados
y repetidos a lo largo de toda la secuencias.
2. Realice la misma comparación
con la misma secuencia de DNA. ¿Qué resultados obtiene?
Discuta los resultados
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3. Obtenga la secuencia de DNA bacteriana con número accesión L12272,
conviertela al formato FASTA, y haga una comparación de la secuencia
consigo misma analizándola con el servidor Dotlet. Juegue con
el tamaño de la ventana y los niveles de homología (niveles de grises que corresponde
a niveles de estringencia o porcentaje en las homologías) para poner de
manifiesto la presencia de terminadores en la secuencia o de secuencias
palindrómicas.
Discuta los resultados
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4. Obtenga la secuencia de
proteína P13823, y compárela consigo misma con
cualquiera de los programas de comparación de matriz de puntos.
Verá resaltada las porciones de las secuencias con baja complejidad
(secuencias repetitivas). Busque en las anotaciones del gen para describir
la posible funcionalidad de dichas secuencias.
Discuta los resultados
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5. Use el servidor
NCBI para extraer las secuencias que se indican abajo. No olvide convertirlas
todas al formato FASTA. Compárelas todas entre sí con
el servidor Dotlet
usando como referencia el segundo CDS de m64683.
- M64683. De esta
secuencia de DNA, extraiga la secuencia de proteína
correspondiente a la fase de lectura 2, que corresponde a una proteína
que confiere resistencia al antibiótico actinorrodina en
Streptomyces coelicolor, que es la bacteria que fabrica este
producto. Esta secuencia coincide con la que posee el númere
de accesión P46105 en la base de datos Swiss-Prot.
Hágalo mediante el paquete Wisconsin. Hágalo directamente
desde el servidor de Internet.
- P52600. Se trata
de una proteína capaz de conferir resistencia a varias drogas
en E.coli.
- P39886. Se trata
de una proteína capaz de conferir resistencia a Tetracenomycina
C a base de excretar este compuesto
- P42670. Capaz
de conferir resistencia a puromicina.
- Q00538. Capaz
de conferir resistencia a Metilenomicina A
- Será necesario que extraíga información de las anotaciones
y referencias cruzadas que pueda obtener de las secuencias, y que estudie o valore los resultados obtenidos
con las comparaciones hechas con el servidor Dotlet.
- Razone y proponga una teoría que explique los datos obtenidos
- Trate de describir a grandes rasgos cómo funcionan estas proteínas relacionandolas con la función biológica que tienen. Indique si es posible que estas secuencias tengan en determinados lugares dominios.
Discuta los resultados
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[Tarea a realizar] Como estos problemas solemos hacerlos en clase, ahora os sugiero que hagais la comparación con Dotlet de las proteínas con número de accesión P08246 y P05049. No solo deberíais compararlas, sino interpretar los resultados buscando información relevante en las anotaciones de dichas proteínas. También os recomiendo que useis el botón "Print" que viene en la aplicación para poder copiar y obtener imagenes que podais incorporar a la pagina WEB
- [Tarea a realizar] Haga lo mismo con la proteína Q9P255
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- Compare la secuencia de ácido nucleico J05545 con la secuencia de proteína P60204 usando Dotlet que se puede obtener desde ESTE ENLACE. Interprete los resultados
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| Prácticas
que realizan búsquedas y comparaciones con los servicios BLAST
y FASTA
Se
recomienda el uso de estos servicios en los servidores Internet de EMBL,
NCBI y DDBJ |
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- (Hacer en clase) Busque la secuencia de ácido nucleico correspondiente al numero de accesion Z69596.
- Haga
con él tanto un BLASTN con la opción Highly similar sequences (megablast)
- Compare los resultados obtenidos cuando haga el BLASTN con la opción More dissimilar sequences (discontiguous megablast)
- Analize e Interprete los
resultados.
- ¿Con cuantas
proteínas diferentes o con diferentes funciones encuentra similaridad en ambos casos (es decir, con el megablast, y con el doiscontinuous megablast?
- Trate de encontrar una
explicación los resultados obtenidos con BLASTN, en particular al hecho de que este gen se parece a dos proteínas con distinta actividad, como es la peptido metionina sulfoxido reductasa y proteasas. Para ello, es aconsejable
que realize un esquema que muestre cómo están organizados
los genes.
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- [Tarea a realizar] En nuestro grupo de investigación hemos querido clonar el gen Ve1 del olivo. Para ello, hemos diseñado una serie de cebadores con lo que hemos obtenido bandas mediante PCR que han sido tratadas de clonar en un vector de clonación. para confirmar dicha clonación, dos de estos plásmidos han sido enviado a secuenciar a empresas dedicadas a ello, y estas empresas nos han enviado los dos cromatogramas siguientes:
¿Podría indicar si hemos tenido éxito o no en haber clonado el gen Ve1 ? |
- Instrucciones para instalar Blast localmente en ordenadores Linux (Ubuntu)
- Puede instalar del tirón Blast localmente y permitir su uso en el PATH de Linux siguiendo estas instrucciones
- Esta página también proporciona un tutorial breve de cómo usarlo. (No dejes de usar cualquiera de los comandos con el cualificador -help para obtener detalles)
- O puede instalarlo manualmente con las instrucciones de esta página del NCBI (atención, hay versiones para Linux 32 y 64bits).
- ATENCION: la tabla 2 de este documento explica los diferentes comandos que se pueden ejecutar
- Mirar el apartado de Configuración para que se pueda ejecutar en el PATH
- Ver el apartado Execution and Validation para ver las opciones de BlastN que sirven de referencia para el resto de los comandos
- Siga algunos ejemplos de este tutorial para aprender a utilizarlo
Aunque se puede instalar en Windows, conviene usarlo en Linux
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- [Tarea a realizar AVANZADA] Se os solicita que cloneis en el aguacate el ortólogo del gen que codifica la polifenol oxidasa (es decir, un gen en el aguacate que presenta homologia con la polifenol oxidasa). La idea final es tratar de hacer una construcción que contenga este gen para hacer iRNA (ARN de interferencia) o antisentido para bloquear la expresión de este gen en el aguacate.
- El procedimiento implica:
- Buscar si este gen está clonado y anotado en aguacate
- Si no está clonado y/o anotado, buscar una base de datos alternativa para encontrarlo
- Diseñar cebadores de PCR para clonarlo
¿De qué herramientas disponemos?
- De bases de datos publicadas y anotadas como las que hay en Genbank
- De bases de datos publicadas pero no anotadas como las que hay en la base de datos SRA, bases de datos high throughput, bases de datos de genomas
- De la información proporcionada por el paquete de programas contenido en sratoolkits si es que se encuentra en la base de datos SRA (necesario para descargar los datos)
- De la herramienta Pick Primers y otras que hay en Google para el diseño de cebadores
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